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2022-01-18 瀏覽次數：2083

1.1.欲冷凍保存的細胞應在生長良好的指數生長期且高存活率，約為80-90%的匯合度。

1.2.冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如雜交瘤細胞應在冷凍保存前一至二日測

試是否有抗體之產生。

1.3.注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色。4℃避光保存，勿作多次解凍。甘油亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

1.4.冷凍保存之細胞濃度： DMSO 的濃度介于 5%~20% 之間。生長培養液的體積應調整以適于所用細胞保護劑的變化。

1.4.1.正常人成纖維細胞:1-3×106 cells/ml

1.4.2.雜交瘤細胞:1-3x106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤細胞會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后si去。

1.4.3.貼壁的腫瘤細胞系:5-7x106cells/ml，依細胞種類而異。腺癌解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1-3×106cells/ml。

1.4.4.其他懸浮細胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte須至少5×106cells/ml。

1.5.冷凍保護劑濃度為5%或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同

時，亦應作一個對照培養，以防止冷凍失敗。+n6

2.細胞冷凍保存的具體操作

2.材料：

2.1.生長良好之培養細胞

2.2.新鮮培養基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.無菌塑料冷凍保存管

2.5.0.4％ w/v臺盼藍

2.6.血球計數盤與蓋玻片

2.7.等速降溫機(KRYO10SeriesII)

3.步驟：

3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。

3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養基中，最后濃度為5-10％，

混合均勻，置于室溫下待用。

3.3.依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液(約20ul)計數細胞濃

度及凍前存活率。

3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，對應細胞適合的凍存密度混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/管，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

3.5.冷凍保存方法：在每一個凍存管上注明細胞系的名字，凍存者姓名和凍存時間，方便日后尋找。將一批細胞用橡皮筋捆綁住，用足夠多的棉花將凍存管包裹，包括燒杯的底座和瓶頂，保護細胞逐級冷卻，防止過快冷凍產生的冰晶破壞細胞狀態，放入-80℃冷凍，然后放置于液氮中。